Fluoreszenz in situ Hybridisierung

Die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung auf Englisch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ist eine zytogenetischen Technik, die verwendet werden können, zu erkennen und zu lokalisieren, die Anwesenheit oder Abwesenheit von spezifischen DNA-Sequenzen in Chromosomen. Es verwendet die Fluoreszenzsonden, die in einer hochselektiven Art und Weise auf bestimmte spezifische Regionen des Chromosoms zu binden. Um die Bindungsstelle zwischen der Sonde und dem Chromosom unter Verwendung von Techniken der Fluoreszenzmikroskopie zu identifizieren.

Prozess

Zunächst einmal müssen wir die Sonde, die lang genug ist, um genau das Ziel hybridisieren vorbereiten müssen, aber es darf nicht zu groß sein, um den Prozess zu verhindern, und kann mit direkter oder indirekter Methoden markiert werden: Bevorzugt sind indirekte Verfahren, in dem das Signal bestimmt wird, nicht direkt von einem Fluorochrom an ein Nukleotid der Sonde gebunden ist, sondern durch die Wechselwirkung von Biotin oder Digoxigenin immer an ein Nukleotid der Sonde verbunden ist, mit Substraten direkt an ein Fluorochrom gebunden. Diese Methode wird die Anzeige eines Signals besser und intensiver zu ermöglichen, in bezug auf eine direkte Markierung von dem Nukleotid der Sonde. Es kann auf verschiedene Weise erfolgen, zum Beispiel mit der Nick-Translation und Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung der markierten Nucleotide.

Dann erzeugt er eine Chromosomenpräparation. Die Chromosomen sind fest mit dem substrato-, üblicherweise aus Glas angebracht ist. Nachdem die Vorbereitung auf die DNA des Chromosoms angewendet der Sonde und beginnt die Hybridisierung. In vielen Passagen waschen alle Sonden hybridisiert oder teilweise hybridisiert werden entfernt.

Wenn eine Signalverstärkung erforderlich, um die Grenze der Empfindlichkeit des Mikroskops fluoreszierenden Antikörpern oder Streptavidin binden an markierten Verbindungen überschreiten, um die Fluoreszenz zu verstärken.

Schließlich wird die Probe dann in einer Verbindung nicht-Whitening gegeben und mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet.

Interphase FISH

Interphase FISH Sonde an vorbereitet mit Kerne aufgetragen, die auch in Cytospin Zubereitung Paraffinschnitten oder sogar von Paraffinblöcken extrahierten Kernen. Die Hybridisierung wurde in einer ähnlichen Weise durchgeführt. Die Fluoreszenzsignale werden als Punkte im Zellkern, die in der Regel mit einer Kontrastfarbe, die die DNA erkennt gefärbt gesehen.

Fiber FISH

In faser FISH werden Chromosomen in Interphase auf einen Glasobjektträger in einer Weise, dass sie in einer geraden Linie verlängert befestigt anstelle Coiled als gewöhnlich, oder indem eine zufällige Konformation, wie in der Zwischenphase FISH. Er tut dies unter Verwendung der mechanischen Scheren entlang der Folie oder auf die Zellen, die auf dem Glasobjektträger fixiert wurden und dann geschnitten wird, oder zu einer Lösung von gereinigter DNA. Abrollen der Chromosomen ermöglicht eine viel höhere Auflösung. Die Herstellung von Faserproben FISH, obwohl konzeptionell einfach, in der Tat ist es so komplex ist, daß sie fast eine Technik definiert werden, und dies bedeutet, dass sie in der Regel nur in Speziallabors hergestellt.

Anwendungen

Die Fische können verwendet werden, um die Sequenzen von einem bestimmten Chromosom zu kartieren. Obwohl es auch andere Möglichkeiten, um dies zu tun, ist der Hauptvorteil von FISH, dass sie nicht auf der Rekombination abhängen und kann in chromosomale Regionen, in denen sie unterdrückt wird, wie in dem Zentromer verwendet werden. Es kann verwendet werden, um die repetitive Sequenzen, die an verschiedenen Stellen des Chromosoms auftreten abzubilden.

Die Fische können auch Farb Chromosomen zum Vergleich zweier Art oder Sorte mit Hilfe der DNA ganzer Chromosomen oder sogar auch das gesamte Genom einer Art oder einer Vielzahl als Sonde bei der Untersuchung einen anderen Arten oder Sorten verwendet werden. Auf diese Weise kann Abnormitäten der Chromosomen identifiziert werden und kann daher folgern evolutionären Beziehungen.

Die Fische können verwendet werden, um Mikroorganismen zu identifizieren und werden verbreitet auf dem Gebiet der microecologia verwendet. Biofilme sind beispielsweise komplexe Multispezies Bakterien Organisationen. Bereiten Sie die Sonden für eine Spezies und FISH mit dieser Sonde ermöglicht es Ihnen, die Verteilung dieser Art in spezifische Biofilm anzuzeigen. Vorbereitung der Probe für zwei Arten ermöglicht, zu beobachten und zu studieren die Platzierung dieser beiden Arten im Biofilm und enthüllt das Ende der Biofilmarchitektur.

FISH ist auch in klinischen Studien, um herauszufinden, ob ein Patient mit einem Pathogen infiziert sind Bakterien aus Geweben oder Flüssigkeiten von dem Patienten entnommen normalerweise auf dem Agar-Agar entwickeln, um die Identität des Erregers zu bestimmen. Jedoch viele Bakterien, einschließlich derer seit einiger Zeit bekannt ist, nicht sehr gut wachsen im Labor. Die Fische können verwendet werden, um das Vorhandensein des Pathogens direkt definieren an den Proben des Gewebes des Patienten.

Bakterien FISH-Sonden sind oft Injektoren für die 16S-rRNA-Region.

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