RACE

Das Akronym steht für RACE rasche Amplifikation von cDNA-Enden und eine molekularbiologische Verfahren, das verwendet wird, um den Bereich mit bekannter Sequenz des Messenger-RNA in der 5 'oder 3' zu erweitern. Die klassischen Techniken der cDNA-Klonierung der Tat produzieren oft nur Fragmente der Sequenz, die durch den Einsatz der RACE verlängert werden kann.

Das Verfahren basiert auf der Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion; Das größte Problem ist es daher, zwei Primer mit den Seiten der Sequenz zu identifizieren, die amplifiziert werden. Einer der Primer können basierend auf der Nucleotidsequenz bereits bekannt ist, sollte sie verlängert werden. Der zweite Primer anstelle ist problematischer und verschiedene Techniken verwendet werden, wie im nächsten Abschnitt zu sehen ist, die Enden 3 'und 5'.

Die Verwendung der Abkürzung RACE ist auch ein Spiel mit Worten, wie in dem englischen Wort Rasse bedeutet das Rennen; Hub genau in einer Richtung oder der anderen der Nukleotidsequenz.

3'-RACE-

Zwischen den beiden Enden, ist es umso leichter, das 3'-Ende zu klonen. Die Boten-RNA der Tat hat an diesem Ende eine terminale Sequenz reich an Adenin. Es ist daher leicht, einen Primer für die Polymerase-Kettenreaktion, die eine hohe Anzahl von Thymin enthält und bindet an das 3'-Ende zu entwerfen. Der andere Primer wird stattdessen auf der Basis der bereits bekannten Sequenz entworfen werden.

5'-RACE-

Die Klonierung des 5'ist komplexer, nicht in der diese eine Nukleotidsequenz Charakteristik tritt bei 3 '. Sie haben daher erfunden eine Reihe von Techniken, die in der Regel auf den Zusatz einer bekannten Sequenz am 5'basieren, so können wir dann verwenden, um einen Primer für PCR ziehen. Der andere Primer wird stattdessen auf der Basis der bereits bekannten Sequenz entworfen werden.

5'-RACE-classic

Die klassische Methode der 5'-RACE besteht in dem 3'-Ende des entsprechenden Ende der cDNA ein Oligonukleotid mit bekannter Sequenz binden. Verwendung des Enzyms terminale Transferase, eine Anzahl von Nukleotiden, die an dem Ende in Frage hinzuzufügen. In diesem Fall wird es möglich sein, um ein PCR-Primer, die von der Anzahl der Nukleotide hinzugefügt basiert entwerfen.

RLM oder Cap-Finder

Andere Methoden der 5'-RACE wurden entwickelt, um zu versuchen, die Nachteile der klassischen RACE überwinden. Zum Beispiel, ist ein großer Vorteil, die zuerst den Oligonukleotid-Ligation nur RNA-Moleküle, die ein Ende 5 'intakt. Dies ist möglich, unter Verwendung der Methode namens Cap-finder oder RLM, der die Kappung des 5'eukaryotischen Botenstoffe verwendet.

In diesem Verfahren werden die RNA-Moleküle mit CIP dephosphoryliert zunächst das Enzym, so dass sie nicht in der Lage, miteinander zu binden, um die Ligase später verwendet, zu bewirken, um zu rendern. Dann öffnet sie die Capping-Moleküle intakt mit einem speziellen Enzym, TAP. Diese Moleküle werden dann der einzige phosphoryliert und nun mit der Ligase wird dann möglich sein, ein Oligonukleotid zu verknüpfen, um nur diejenigen Moleküle sein. Auf diese Weise wurde die folgende PCR in der Lage, die Verwendung als Formmoleküle nur mit 5'-Enden abgeschlossen.

SMART RACE

Die Methode aufgerufen SMART ist die Verwendung eines speziellen reverse Transkriptase für die reverse Transkription von Boten-RNA, um cDNA, die das 5'-Ende der RNA seine enzymatische Aktivität erreicht wird verändert, zu einem Terminal-Transferase, die eine Anzahl von Cytosine fügt an diesem Ende. Sie werden daher dann möglich, PCR-Primer auf der Basis dieser Sequenz von Cytosinen zu entwerfen. Auch dieses Verfahren hat als Vorteil die Auswahl als Form für die Polymerase-Moleküle vollständige 5'-Ende, da nur auf diese ist die Anzahl der Cytosine aufgenommen.

CAP Fischer

Ein zusätzliches Verfahren zur Klonierung heißt Fangkappe und besteht in der Ligation eines Oligonukleotids kann in die 5 'der Boten in Gegenwart Capping binden, und dann nur für Moleküle RNA vollständig. Die Ligation dieses Nukleotid erfolgt mit dem gleichen System zu zwei System Enzyme Cap-Finder und wird dann als Grundlage für den Entwurf der Primer für die Polymerase verwendet werden.

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